GradingPool-Seq使用方法

1. 安装必要的软件和包

在开始之前，你需要确保系统中已经安装了以下软件和包：

Perl (v5.22.1)Perl 模块 (Statistics::Distributions)R (v3.2.5)R 包 (ggplot2)BWA (v0.71)GATK (v4.1.0.0)Picard (v1.119)

安装这些软件和包的步骤在文档中已经提供了链接，你可以按照以下步骤进行安装：

安装 Perl：访问 .perl.org/get.html安装 R：访问 .r-project.org/安装 BWA：访问 github /lh3/bwa安装 GATK：访问 software.broadinstitute.org/gatk/安装 Picard：访问 broadinstitute.github.io/picard/

安装这些工具可能需要一些时间，预计在两小时内完成。

---

2. 安装 Pipeline 框架

将 GradingPoolSeq pipeline 框架安装到你的系统中：

下载框架文件 假设你已经获得了 GradingPool_framework.tar.gz 文件，将其解压到工作目录中：

cd /path/to/working/directory cp /path/to/GradingPool_framework.tar.gz . tar zxvf GradingPool_framework.tar.gz

进入解压后的目录

cd GradingPool_framework

---

3. 准备数据

你需要准备以下数据：

参考基因组文件 (ref.fa)每个批量的 Fastq 文件 或者通过 SNP calling 得到的 VCF 文件（如果已经完成）

---

4. 执行 Pipeline

根据你的数据情况，选择以下两种方式之一：

4.1 如果你没有 VCF 文件（从 Fastq 文件开始）

建立参考基因组索引 使用 BWA 建立参考基因组索引：

bwa index ref.fa

对每个样本的 Fastq 文件进行比对 假设有 6 个批量（4 个 F2 代和 2 个亲本）：

bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool1\tSM:Pool1" ref.fa Pool1.fastq.gz > Pool1.sam bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool2\tSM:Pool2" ref.fa Pool2.fastq.gz > Pool2.sam bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool3\tSM:Pool3" ref.fa Pool3.fastq.gz > Pool3.sam bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool4\tSM:Pool4" ref.fa Pool4.fastq.gz > Pool4.sam bwa mem -M -R "@RG\tID:Parent1\tSM:Parent1" ref.fa Parent1.fastq.gz > Parent1.sam bwa mem -M -R "@RG\tID:Parent2\tSM:Parent2" ref.fa Parent2.fastq.gz > Parent2.sam

将 SAM 文件转换为 BAM 文件

samtools sort -o Pool1.bam Pool1.sam samtools sort -o Pool2.bam Pool2.sam samtools sort -o Pool3.bam Pool3.sam samtools sort -o Pool4.bam Pool4.sam samtools sort -o Parent1.bam Parent1.sam samtools sort -o Parent2.bam Parent2.sam

标记重复序列 使用 Picard 工具标记重复序列：

java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool1.bam OUTPUT=Pool1.dedup.bam METRICS_FILE=Pool1.metrics java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool2.bam OUTPUT=Pool2.dedup.bam METRICS_FILE=Pool2.metrics java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool3.bam OUTPUT=Pool3.dedup.bam METRICS_FILE=Pool3.metrics java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool4.bam OUTPUT=Pool4.dedup.bam METRICS_FILE=Pool4.metrics java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Parent1.bam OUTPUT=Parent1.dedup.bam METRICS_FILE=Parent1.metrics java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Parent2.bam OUTPUT=Parent2.dedup.bam METRICS_FILE=Parent2.metrics

索引 BAM 文件

samtools index Pool1.dedup.bam samtools index Pool2.dedup.bam samtools index Pool3.dedup.bam samtools index Pool4.dedup.bam samtools index Parent1.dedup.bam samtools index Parent2.dedup.bam

进行 SNP calling 使用 GATK 的 HaplotypeCaller：

java -jar gatk --java-options "-Xmx4g" HaplotypeCaller -R ref.fa -I Pool1.dedup.bam -I Pool2.dedup.bam -I Pool3.dedup.bam -I Pool4.dedup.bam -I Parent1.dedup.bam -I Parent2.dedup.bam -O Results.vcf 4.2 如果你已经有 VCF 文件

你可以跳过上述步骤，直接从 VCF 文件开始。

---

5. 数据过滤

使用 Perl 脚本对 VCF 文件进行过滤：

过滤低质量变异

perl Filter_Quality.pl Results.vcf > filter1.txt 100

选择合适深度的变异

perl Filter_Depth.pl filter1.txt > filter2.txt 6 0.05 0.95

筛选亲本中基因型不同的变异

perl Filter_Parent.pl filter2.txt > filter3.txt 5 6

过滤所有池中非参考碱基的 SNP

perl Filter_SNP.pl filter3.txt > filter4.txt 6 1 2 3 4

---

6. 计算 P 值

使用 Perl 脚本计算 P 值：

perl Ridit.pl filter4.txt > pvalue.txt 1 2 3 4

---

7. 去噪策略

使用 Perl 脚本进行去噪：

perl denoise.pl pvalue.txt > ratio.txt 4 10 12

---

8. 图形分析

使用 R 脚本生成图形：

生成 P 值图

Rscript pos-pvalue.R

生成比例图

Rscript pos-ratio.R

---

9. 识别峰值区间

使用 Perl 脚本识别峰值区间：

perl p-max.pl ratio.txt 1

---

10. 查看结果 P 值图：查看 pvalue.png 文件。比例图：查看 ratio.png 文件。峰值区间：查看 p-max.pl 的输出。

---

注意事项 参数调整：根据你的数据和需求，可能需要调整脚本中的参数（如质量阈值、深度范围等）。脚本路径：确保所有脚本文件（如 Filter_Quality.pl、Ridit.pl 等）的路径正确。运行时间：整个流程可能需要较长时间，具体取决于数据量和计算资源。